共同研究報告書


研究区分 一般研究

研究課題

 多雪地域森林環境における好雪性変形菌の生態解明
新規・継続の別 新規
研究代表者／所属 静岡県立大学
研究代表者／職名 助教
研究代表者／氏名 梅澤和寛

研究分担者／氏名／所属／職名
　
氏　　名
所　　属
職　　名

1

 出川洋介 筑波大学 准教授

2

 谷幸則 静岡県立大学 教授

3

 福井学 北大低温研

研究目的 変形菌はその名が示すとおり、形態をアメーバ状態から胞子を含む子実体へとライフステージによって変化させる原生生物である。森林における腐食連鎖に重要な役割を担うと考えられているが、一部を除き未培養のためその生態は大部分が未解明である。我々はこれまでに、新規に設計した変形菌の18S rRNA遺伝子を標的としたプライマーを用いて変形菌の菌叢解析を試みた。その結果、データベースに登録のない新規遺伝子配列が雪中から多く検出された。本研究では、形態学に基づき種同定のされた変形菌の子実体を用いて、新たにプライマーを用いてPCR解析ができるか検討した。
　　
研究内容・成果 　我々は、筑波大学の菅平高原実験所の研究林から採取した雪や土壌試料を用いて18S rRNA遺伝子を標的としたアンプリコンシーケンス解析を行ってきた。雪中から多く検出された新規配列は、系統解析の結果、Columellomycetidae（有軸亜綱）のPhysaralesに属していた。そこで、同実験所内で発見され、種同定されている標本のうちPhysaralesに属する変形菌（Mucilago crustacea， Lepidoderma chailetii ， Fuligo leviderma ， Fuligo muscorum ）から子実体を一部回収して、DNA抽出を行った。DNA抽出はZymoBIOMICS DNA miniprep kit (Zymo researech)を用いてビーズ法により実施した。抽出DNAを用いて18S rRNA遺伝子を標的としたプライマーでPCRを行った。PCRは、Long Amp Hot start taq x2 master mix (NEB)を用いて、94℃ 30秒間熱変性を行ってから、以下のサイクル条件で実施した。94℃ 30秒間熱変性し、54℃で30秒間アニーリングを行い、65℃ 6分間伸長反応を実施することを30もしくは35サイクル行った。最終ステップとして65℃ 10分間伸長反応を行った。変形菌の18S rRNA遺伝子には、挿入配列があることが多いため伸長時間を長く設定している。PCR産物をアガロースゲル電気泳動によりいずれのサンプルからも変形菌の18S rRNA遺伝子と予想されるバンドが検出された。今後PCR産物をNanoporeで解読してこれまで得られたアンプリコンシーケンス解析の結果と比較していきたい。
　　
成果となる論文・学会発表等