共同研究報告書


研究区分 一般研究

研究課題

 昆虫サイトカイン活性化機構の解明
新規・継続の別 新規
研究代表者／所属 佐賀大農学部
研究代表者／職名 招へい教授
研究代表者／氏名 早川洋一

研究分担者／氏名／所属／職名
　
氏　　名
所　　属
職　　名

1

 落合正則 北大低温研

研究目的 本研究で着目するサイトカインは、発育阻害ペプチド（Growth-blocking peptide， GBP）という昆虫特有のサイトカインであり、寄生蜂によって寄生された宿主昆虫の体液中に発見された生理活性ペプチドである (Hayakawa Y.， J. Biol. Chem.，265，10813-10816 (1990))。 GBPは前駆体(proGBP)として主に脂肪体で合成され体液中に分泌されることによって常時一定濃度する事が確認されている。proGBPは各種ストレスに晒された昆虫体内で活性化してストレス下においても昆虫の恒常性を保つべく生理的体内環境を調節する重要な役割を担っている。本研究では、proGBPのストレス依存的な活性化の分子機構を明らかにする事を目的とする。
　　
研究内容・成果 GBP前駆体からGBPへの活性化はセリン型プロテアーゼによる特定のペプチド結合の切断によって起こる。先行研究によって、特異的セリン型プロテアーゼによるproGBPの加水分解反応をより正確に測定する為に人工基質proGBP-CVH（proGBPのカルボキシル末端にV5エピトープとポリヒスチジンタグを結合した修飾ペプチド基質）を合成した。この合成基質を用いることによって、proGBPプロセシング反応を迅速かつ高感度に定量分析することが可能になった。予備実験によって、proGBPのプロセッシング反応過程には活性酸素種（Reactive oxygen species: ROS）が関与する事、更にROSは血球を刺激してproGBPプロセッシング酵素を活性化する液性因子を分泌すること事が明らかになった。今年度は、特に、血球から分泌される活性化因子のROS依存的な分泌機構と活性化因子の特性について解析を行った。
　まず、アワヨトウ幼虫から調製した血球を2mM 過酸化水素と共に5分間培養した培養液中にproGBP活性化酵素を活性化する活性が検出されることを確認した。しかし、この培養液に2mM N-acetylcysteineを添加した場合には活性を消失することが分かった。さらに、2mM 過酸化水素共存下での血球の培養液に10 mM EGTAを添加してもproGBP活性化酵素の活性化活性は見られなかった。これらの実験結果より、活性酸素依存的な血球からのプロセシング酵素活性化因子の放出にはカルシウムイオンの関与があるものと予想した。この解釈は過酸化水素の代わりにcalcium ionophore A23187を添加することにより、血球内カルシウムイオン濃度を上昇させることによって活性化因子の分泌が促されるという実験結果によって正当化できた。次に、活性酸素依存的に血球培養液に分泌されたproGBP活性化酵素活性化因子の精製を試みた。まず、SP-Sepharose FFカラムとHiTrap Heparin HPカラムによって部分精製を完了した。この活性分画をHiTrap Benzamidine FFカラムによって分画した場合、活性因子は0.37 M NaClによって溶出することが明らかになった。この活性因子分画をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した結果、分子量約50kDa付近に1本のタンパク質バンドが観察された。このタンパク質バンドをアクリルアミドゲルから抽出して一次構造分析を行ったが、サンプル量が検出限界以下であった為に有益な情報は得られなかった。したがって、血球培養液の大量調製、カラム精製、電気泳動による約50kDaタンパク質の単離を10数回繰り返した。得られた精製タンパク質について再度LC-MS/MSによる一次構造解析を実施中であるが、残念ながら現時点では結果が得られていない。
　　
成果となる論文・学会発表等