共同研究報告書提出

共同研究報告書

研究区分	一般研究
研究課題	生態系及び代謝経路解析に用いられるアミノ酸解析技術の高度化と新規解析基盤構築
新規・継続の別	継続（R04年度から）
研究代表者／所属	国立研究開発法人海洋研究開発機構
研究代表者／職名	副主任研究員
研究代表者／氏名	澄田智美

研究分担者／氏名／所属／職名
	氏　　名	所　　属	職　　名
1	布浦拓郎	海洋研究開発機構	上席研究員
2	福山宥斗	海洋研究開発機構	研究員
3	力石嘉人	北大低温研	教授

研究目的	生態系及び代謝経路解析に用いられるアミノ酸解析技術において、力石らは以前増殖効率の低い環境微生物にも適用できる代謝解析手法（GC-MS法）の開発を行い、さらに本共同研究を通じてキャピラリー電気泳動インターフェイスとオービトラップ搭載MSを用いた新規CE-MS法の開発を行ってきた。その際、CE-MS法の開発の過程にて、GC-MS法における試料の調整法やデータの解析に技術課題が発見された。よって本年度の研究ではGC-MS法の問題点を解決するために、GC-MS法とCE-MS法の比較及びデータ解析法の検証を行い、従来見過ごされてきた技術課題の解決とアミノ酸解析技術の高度化を目的とした。

研究内容・成果	本研究では、極限環境微生物の培養を行う際に、個々の炭素を区別して同位体標識したラベル化アミノ酸基質（1-13C-Glu， 5-13C-Glu， 13C5-Gluなど）を投与し、培養後にアミノ酸や有機酸等の代謝産物を菌体から抽出してGC-MS法及びCE-MS法で代謝解析を行った。好熱性バクテリア系統のAquificaeでのAla， Asp， Gluの解析結果を元にGC-MS法とCE-MS法を比較検証した結果、GC-MS法の手法でこれまで計算上考慮されていなかったアミノ酸を分析した際に生じていた未同定の夾雑ピークが、バックグラウンドではなく、既報とは異なるアミノ酸自身に由来するフラグメンテーションのピークであることが判明した。よってアミノ酸のフラグメント化の詳細な解析を行うために、GC-MSで検出可能なすべてのアミノ酸に対して、13Cラベルなしのアミノ酸と1位にラベル化した1-13C-アミノ酸を誘導体化してGC-MSでの測定を行い、それぞれのフラグメンテーションパターンの解析を行った。その結果、どのアミノ酸のフラグメンテーションも一方向からだけではなく、多方向から起こっていることが判明した。また、ラベルあり・なしのアミノ酸を用いた比較検証の結果から、それぞれのピークの同定は、今回新しく発見したフラグメンテーションパターンと矛盾がないことも確認できた。この多方向からのフラグメンテーションパターンはこれまで解析上考慮されていなかったため、今後これらの結果をまとめて論文で報告する予定である。

成果となる論文・学会発表等	論文 Y. Fukuyama， S. Shimamura， S. Sakai， Y. Michimori， T. Sumida， Y. Chikaraishi， H. Atomi， T. Nunoura， Development of a rapid and highly accurate method for 13C tracer-based metabolomics and its application on a hydrogenotrophic methanogen， ISME Commun. 4(1):ycad006， 2024 学会発表福山宥斗、島村繁、酒井早苗、道盛裕太、澄田智美、力石嘉人、跡見晴幸、布浦拓郎. Orbitrap Fusion MSを活用した高感度且つ高精度なトレーサー解析、第17回メタボロームシンポジウム、2023.10.19、布浦口頭発表福山宥斗 et al. A novel CE-MS based tracer metabolomics: a promising tool to verify real amino acid biosynthetic pathways and central carbon metabolic pathway in any kinds of microbial isolates、Gordon Research Conference、2023.7.25、布浦ポスター発表福山宥斗、島村繁、澄田智美、力石嘉人、跡見晴幸、布浦拓郎. Assimilation of CO2 in hyperthermophilic and heterotrophic bacteria revealed by 13C tracer-based metabolomics using CE-MS、The 36th JSME & The 13th ASME、2023.11.28、福山口頭発表