共同研究報告書
| 研究区分 | 一般研究 |
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研究課題 |
昆虫のストレス依存的サイトカイン活性化機構の解析 |
| 新規・継続の別 | 新規 |
| 研究代表者／所属 | 北海道大学低温科学研究所 |
| 研究代表者／職名 | 准教授 |
| 研究代表者／氏名 | 落合正則 |
| 研究分担者／氏名／所属／職名 | |||
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氏 名
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所 属
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職 名
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1 |
早川 洋一 | 佐賀大学 | 名誉教授 |
| 研究目的 | 熱帯から極域までの陸地に生息する昆虫は低温などの様々な環境ストレスを乗り切るために、進化の過程で多様な適応機構を獲得してきた。種々のストレス応答性の発現に不可欠なサイトカインによる生理的恒常性の維持は極めて重要で、昆虫では発育阻害ペプチドGBPという昆虫特有のサイトカインがストレス応答に関与している。GBPは不活性な前駆体proGBPとして合成され、定常的に昆虫体液中に存在し、ストレス応答の際には、現在未同定のプロセシング酵素によって特定の部位が切断されて活性化すると考えられている。本研究では、活性型GBPへの変換を行うプロセシング酵素の同定と活性調節機構を明らかにすることを目的としている。 |
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| 研究内容・成果 | まず、proGBPを限定加水分解によって活性化するプロセシング酵素を同定するために、カイコ幼虫体液を出発材料として種々のタンパク質分画方法を用いて精製を試みた。精製はproGBPを活性型GBPへの変換する活性を指標にして行い、カイコ体液の硫安分画の後、陰イオン交換カラム、ヘパリンカラム、ゲルろ過カラムの順にクロマトグラフィーで分画した。最も変換活性の強い画分をSDS電気泳動で分析し、プロセシング酵素と考えられる分子量帯のタンパク質バンドを抽出後、LC-MS/Ms分析した。分析結果をデータベースUniProtKB (uniprot-Bombyx+mori.fasta)に対して検索したところ、ショウジョウバエGastrulation Defectiveというセリンプロテアーゼにアミノ酸配列が似ているカイコホモログが見つかった。Gastrulation Defectiveは、胚発生において背腹軸決定に関わるセリンプロテアーゼカスケードの構成因子であり、タンパク質を限定加水分解する活性を持つものである。ショウジョウバエの胚以外、特に体液中にGastrulation Defectiveが存在することが見つかった初めての例である。現在、カイコゲノムの塩基配列情報を基にカイコGastrulation Defectiveの人工遺伝子を合成し、昆虫細胞でGastrulation Defectiveタンパク質の組換え体の発現を試みている。組換え体の調製後、proGBPを変換する活性やGastrulation Defective自身の活性発現と活性酸素種ROSの関係を調べる予定である。また、ショウジョウバエ実験系では、ショウジョウバエGastrulation Defective遺伝子プロモーター領域-レポーター遺伝子コンストラクトを作成した。このコンストラクトをショウジョウバエ培養細胞のS2細胞へ導入し、S2細胞分析系を構築する予定である。様々なストレスを与えた培養条件下にS2細胞内での酵素遺伝子発現レベルを分析すると同時に、GBPの活性化に必須の条件を明らかにすることを計画している。 |
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| 成果となる論文・学会発表等 | |