共同研究報告書提出

共同研究報告書

研究区分	一般研究
研究課題	植物由来の新規氷核活性物質の氷晶形成機構の解析
新規・継続の別	継続（H31年度から）
研究代表者／所属	東京大学大学院農学生命科学研究科
研究代表者／職名	特任研究員
研究代表者／氏名	石川雅也

研究分担者／氏名／所属／職名
	氏　　名	所　　属	職　　名
1	久保光	東大・農学部	博士課程
2	佐崎元	北大低温研
3	長嶋剣	北大低温研

研究目的	高耐寒性植物組織は種や組織に特異的な凍り方を示し、組織の水の凍結を積極的に制御することや多様な凍結制御作用物質の宝庫であることが判ってきた。本課題では組織の凍結開始に関わる氷核活性について研究する。本年度は申請者が見出した植物に含まれる新規な氷核活性物質COMについて研究を進める。COMの結晶構造や分子動力学的解析から氷核活性のある結晶面が予想される。今回、実験的にCOM結晶から本当に氷晶形成が生じ、予想される結晶面から発生するか、どんな氷晶が生じるかを低温研で開発された氷結晶発生観察装置等で解析する。これによりCOMが氷核活性物質であることの証明やその氷晶形成機構解明に資することを目指す。

研究内容・成果	本年度は引き続き、申請者らが植物から見出した新規氷核活性物質であるシュウ酸カルシウム一水和物（COM）結晶について主に研究を進めた。高い氷核活性を有するレンギョウ枝髄から単離したCOM結晶は、単離物でも-2℃程度の氷核活性を有する。しかし、大きさが10μm程度で、この結晶1個の結晶面からの氷結晶発生の観察は、非常に困難である。解決法としてCOM鉱物結晶を利用することが考えられ、これについて前年に続き検討した。鉱物由来のCOM結晶はWhewelliteとして知られ、様々なチェコ、ドイツなどの鉱山の副産物として産出される。産出鉱山により結晶の形状や大きさも異なるため、多種のWhewellite鉱物を世界の収集者の協力を得て入手し、これらから約300個のWhewellite結晶（0.5mm～5mm程度）を基盤鉱物から剥離・割断して単離した。鉱物試料の場合、生成過程（条件・時間等）が生物内と大きく異なることが予想され、典型的な発達結晶面も異なることが予想される（生物では[100]面は発達しやすいが、鉱物では必ずしもそうではない可能性がある）。そこで昨年に引き続き、東京大学物性研究所の矢島氏の協力により、これらの微小鉱物結晶COMと大型単結晶1個について、さらなる露出結晶面の同定を進めた。ほとんどの結晶では、[100]面は露出していなかった。このため通算で、明確な[100]面を確認できたものは1個だけである。この結晶を用いて、低温研において、氷生成観察実験を行う予定であったが、Covid19の長期間の緊急事態宣言の影響で、次年度へ延期となった。一連の解析から、生物内COMでは一般的な[100]面は、鉱物ではまれにしか露出しない結晶面であることが判ってきた。見出した結晶も大きな単結晶を砕いて小さくしたものである。偶然、運よく[100]面が劈開したと思われる。鉱物COM結晶では、生成過程（条件・時間等）が生物内COM結晶とは大きく異なることが原因と考えられる。　さらに、[100]面をもつCOM鉱物結晶の探索を矢島氏の協力の下、進める予定である。単離した[100]面が露出していない多数の微小結晶についても氷核活性測定を進める予定である。これまでの結晶の六方晶性と分子動力学シミュレーションから、 [100]面に氷核活性があることが予想されていたが、これ以外の結晶面にも氷核活性がある可能性も含め、解析を進めていく。また、最近新しいCOM，CODの合成法が国内で報告されており、生成結晶の大きさも比較的大きいことから、これらの研究グループとの協力も計画している。

成果となる論文・学会発表等	Ishikawa M et al 2022 Preferential freezing avoidance localized in anthers and embryo sacs in wintering Daphne kamtschatica var. jezoensis flower buds visualized by MRI. Plant Cell Environ (in print) Ishikawa M 2021 Visualization of freezing behaviors in plant organs: diversity and mechanisms involved. 12th International Plant Cold Hardiness Seminar， Invited 久保光，石川雅也他 2020 ササ類に含まれる氷核活性物質の探索　低温生物工学会誌66:105-109 Ishikawa M et al 2018 Ice nucleation activity in plants: the distribution， characterization and their roles in cold hardiness mechanisms. Survival Strategies in Extreme Cold and Desiccation. Springer，pp99-115 石川雅也 2018 植物由来の凍結制御物質の探索と機能評価不凍タンパク質の機能と応用 CMC出版 Ishikawa M et al 2016 Freezing behaviors in wintering Cornus florida flower bud tissues revisited using MRI. Plant Cell Environ 39:2663-2675 石川雅也，野村孝之，槌谷明日香 2016 シュウ酸カルシウムを含む氷核活性剤特許第6029058号