共同研究報告書


研究区分 一般研究

研究課題

 北方森林土壌の細菌と真核微生物群集の動態解明の試み
新規・継続の別 新規
研究代表者／所属 宮城教育大学
研究代表者／職名 准教授
研究代表者／氏名 島野智之

研究分担者／氏名／所属／職名
　
氏　　名
所　　属
職　　名

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 笠原康裕 北大低温研

研究目的 土壌の細菌群集および真核微生物群集構造解析は，土壌環境中に存在する細菌・真核微生物細胞数，群集構造（種組成や構成種の相対比），多様性やその群集構造と土壌機能との関連性，微生物間や植物などの生物間相互作用などを明らかにしようとするものである．
　本研究では，北方森林土壌を研究対象として，細菌と真核微生物の相互作用にもとづく群集動態の解明のために，土壌の繊毛虫群集をクローンライブラリ法をもちいて解析し，真核微生物由来のDNAに着目して，帰属生物種の種類，構成比，多様性について解析の可能性を探索する．
　　
研究内容・成果 土壌の微生物群集構造解析は，土壌環境中に存在する微生物数，群集構造（種組成や構成種の相対比），多様性やその群集構造と土壌機能との関連性，微生物間や植物などの生物間相互作用などを明らかにしようとするものである．環境中の微生物は99％が培養不可能であるという認識から，環境より抽出したDNA（環境DNA）を利用した「非培養法」は近年ポピュラーな手法となり，主として16S rDNA配列に基づく系統学的解析が行われている．また，環境DNAそのものを網羅的に解読する「メタゲノム」が登場し，これを足がかりに微生物生態学にゲノム生物学の手法や考え方を取り入れた「環境コミュニティー研究」が展開しつつある．北方森林土壌を研究対象として，今後，群集構造動態と，原生生物-微生物相互作用を解析するために，以下の研究を行った．
　環境DNAを用いた繊毛虫クローン・ライブラリー法：これまで土壌中の真核生物については環境DNAを使用した群集解析の報告があった．しかし，繊毛虫という機能群を対象に，その動態を解明する手法はなかった．特に，真核生物プライマーを用いた解析では，繊毛虫の動態がマスクされてしまう危険性が高いことが予想されていた．そこで，Nested PCR法と特異的プライマーの使用し，かつ，リボゾーマルDNAの特定の領域を使用することによって，繊毛虫群集をクローン・ライブラリー法によって明瞭に解析することが可能になった．
　我々のクローン・ライブラリー解析の結果，6網の繊毛虫のグループに属する塩基配列を得た（全繊毛虫は11綱に体系付けられる）.また，どの処理区においても，Stichotrichia綱，Colpodea綱に属すると考えられるクローン体が多くを占めていた.この傾向は高橋ほか (2003)の顕微鏡観察の結果と同様であった.クローン・ライブラリー法で検出されず，顕微鏡観察で見いだされたのは，Nassophoreaの1綱であった.一方，顕微鏡観察で見いだせず，クローン・ライブラリー法で検出されたものはHeterotricheaとLitostomateaの2綱であった.今後，クローン数を増やすことで，処理区間の偏りが改善され，検出される繊毛虫類の分類群が増加することが予想された.従って，これまでの長期間労力を要する培養と顕微鏡観察をともなうこれまでの手法に比べて，分子生物学的手法は，短時間で広範囲な繊毛虫群集の把握が可能であることが示唆された.
　　
成果となる論文・学会発表等