共同研究報告書提出

共同研究報告書

研究区分	一般研究
研究課題	部分循環湖における硫黄代謝に関わる微生物間相互作用の研究
新規・継続の別	新規
研究代表者／所属	玉川大学術研
研究代表者／職名	特別研究員
研究代表者／氏名	小泉嘉一

研究分担者／氏名／所属／職名
	氏　　名	所　　属	職　　名
1	小島久弥	北大低温研
2	福井学	北大低温研

研究目的	塩分濃度や温度の相違によって生じる湖水の成層構造が、年間を通して保たれた状態にある湖は部分循環湖と呼ばれる。こうした湖の深層には酸素が枯渇した嫌気的環境が形成される。また、表層と深層の境界付近では様々な物質が水深に沿った濃度勾配を形成している。このような深層および境界層では、有酸素環境とは異なる微生物群による独自の物質変換過程が進行している。本研究では、水温をはじめとする環境要因が互いに大きく異なる複数の部分循環湖を対象とし、微生物群集構造の解析を行う。これらの結果を比較検討し、好気-嫌気境界層および完全嫌気水界に特徴的な現象を解明することを目的とする。

研究内容・成果	現場に生息している微生物を網羅的に検出するための分子生物学的手法による解析を行った。複数の部分循環湖、および多様な水界生態系に由来する多数の試料間で直接的な比較を行うため、解析手法の統一を図った。解析の手法として変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）を採用し、試料の採取から最終的な結果を得るまでの各過程について詳細に検討した。解析の出発点となる試料からのDNA抽出については、細胞破砕前の洗浄の有無や細胞破砕の方法によって結果がどの程度異なるか検討した。DGGEついては、ゲルの構成（アクリルアミド濃度、厚さ、変性剤濃度勾配）、電気泳動条件（電圧、泳動時間）、染色・観察の方法などの最適化を行い、条件を決定した。決定された解析条件に従い、南極の露岩域に位置する湖沼群で採取された湖水及び堆積物試料の解析に着手した。水深別に採取された湖水、深さ別に切り分けられた堆積物コアからDNAを抽出し、全真正細菌をターゲットにしたPCR-DGGEを行った。その結果、湖水において見られたバンドパターンは単純で、多様性の低さが示唆された。また塩分濃度や温度に起因する成層の境界層においてバンドパターンに大きな変化が見られた。堆積物からは湖水中で見られたバンドの他に新たなバンドが複数現れ、堆積物中にのみ生息する細菌種の存在が確認された。部分循環湖における物質循環においては、硫黄化合物を利用して生育する微生物の働きが重要となることが多い。硫黄循環関与微生物を特異的に検出し解析するための手法の検討を行った。硫黄酸化および硫酸還元に関わる機能遺伝子について、近年相次いで報告された複数のプライマーセットの有効性を検討した。南極および国内の部分循環湖由来の試料から抽出されたDNAを鋳型にPCRを行ったところ、増幅が認められない、あるいは非特異的な増幅の見られるケースが大半を占めた。比較的多くのサンプルで増幅の認められたプライマーセットについてPCR条件の検討を行い、可能な限り多くの試料を同一の手法で解析する予定である。上記の培養に依存しない解析に加え、培養を基盤とする解析も合わせて行った。部分循環を含む様々な環境に由来する試料から、硫黄酸化細菌の集積培養を行った。培養には炭酸塩で緩衝した完全合成培地を用い、電子供与体としてチオ硫酸、電子受容体として硝酸を添加した条件で培養を行った。集積されたバクテリアについては、16S rRNA遺伝子の部分配列を決定した。その結果、既知の硫黄酸化細菌とは系統的に異なるバクテリアが集積されたことが明らかとなった。得られた配列のうちのひとつは、過去に部分循環湖の堆積物からクローンとして検出された配列と一致した。今後、この菌を分離培養し生理学的な特性を明らかにすることで部分循環湖の堆積物中で進行している物質変換過程の一端が明らかにされると期待される。

成果となる論文・学会発表等