共同研究報告書


研究区分 一般研究

研究課題

 越冬性植物の耐寒性機構に関する研究
研究代表者／所属 北大低温研
研究代表者／職名 助手
研究代表者／氏名 荒川圭太

研究分担者／氏名／所属／職名
　
氏　　名
所　　属
職　　名

1

 藤川清三 北大農学研究科 教授

2

 上村松生 岩手大寒冷バイオシステム研究センター 教授

3

 遠藤千絵 北海道農業研究センター畑作研究部 主任研究官

4

 村井麻理 東北農業研究センター 主任研究官

5

 内海泰弘 九州大農学研究院 助手

6

 長尾学 北大農学研究科 農学研究科研修員

7

 荒川圭太 北大低温研

8

 竹澤大輔 北大低温研

研究目的 　本研究では、植物における寒冷環境への適応機構ならびに寒冷環境に起因する環境刺激に対する応答機構を明らかにすることを主な目的としている。本年度は、樹木皮層細胞における低温誘導性遺伝子や蛋白質の性質を明らかにするために、目的の遺伝子を大腸菌にて発現させたリコンビナント蛋白質を用いて、凍結保護活性などの機能について調べた。
　　
研究内容・成果 　クワ(Morus bombycis Koidz)の皮層組織では季節的な低温馴化によって耐寒性が著しく向上するのに伴い、小胞体内腔にはWAP20やWAP27が、細胞質基質にはWAP18やデハイドリン(DHN)がそれぞれ誘導されることを明らかにすると共にこれらの遺伝子を単離した。特にWAP27については、WAP27遺伝子を用いて形質転換シロイヌナズナを作出したところ、低温馴化した場合に野生型に比べてわずかながらに耐寒性が向上しており、同遺伝子の耐寒性賦与への関連性が示唆された。
　本年度の研究では、これらの低温誘導性遺伝子を用いて大腸菌にてリコンビナント蛋白質を発現させ、単離したこれらの蛋白質についてインビトロでの凍結保護活性の有無について調べることにした。なお、WAP18については野外で採集したクワの皮層組織から単離したものを用いた。
　WAP27およびDHNの各遺伝子をそれぞれ大腸菌にて発現させたリコンビナント蛋白質であるrWAP27とrDHNをいずれも大腸菌の抽出液から高度に精製した。また、WAP18は、冬季に野外にて採集したクワの皮層組織から抽出してきた可溶性画分から高度に精製した。これらの蛋白質標品を様々な濃度に調製し、凍結感受性である乳酸脱水素酵素(LDH)の水溶液に添加して-20℃で24時間凍結処理した。それから試料を融解した後、LDHの酵素活性を測定し、当初の酵素活性からの失活の程度を比較した。
　その結果、rWAP27とrDHNを1 - 10 mg/mLという低濃度で添加した場合でもLDH活性は各々70％と40％まで保たれていた。一方、オバルブミン(OVA)や牛血清アルブミン(BSA)、スクロース(Suc)をリコンビナント蛋白質の代わりに用いた場合、OVAやBSAはrDHNの半分以下の保護効果を示し、Sucは保護活性を示さなかった。またWAP18は、rDHNとBSAの中間の保護活性を示した。
　以上の結果から、クワ皮層細胞における冬季誘導性蛋白質であるWAP27、WAP18、DHNは、凍結時にLDHのような凍結感受性蛋白質と共存すると、凍結失活を防ぐ作用(すなわち凍結保護活性)があることが判明した。今後は、このような性質を持つ冬季誘導性の可溶性蛋白質が凍結抵抗性の上昇にどのように関連性があるのか、など植物の耐寒性機構について継続して研究していきたい。